Star Nature

Можливість змінювати фрагменти ДНК завжди була святим Граалем біотехнології та медицини. CRISPR дозволяє робити це з небаченою раніше швидкістю і ефективністю. Вважайте, що біологи раніше працювали на друкарській машинці, а завдяки CRISPR відразу пересіли на MacBook. Не дарма відкриття цього методу в 2020 році отримало Нобелівську премію з хімії.

Визнання до CRISPR прийшло в 2012 році - після публікації нобелівської роботи. Але, як це зазвичай буває в науці, відкриття - не особиста заслуга декількох авторів. Цього разу учасників подій було багато, і почалося все зовсім не з генетики.

Все почалося з «багнюкокопача»

Абревіатура CRISPR з'явилася в кінці 80-х в ході досліджень солончаків поруч з іспанським містом Аліканте. Аспірант Франсіско Мохіка вивчав архей, що живуть в солоній воді, і наткнувся на дивні паліндромні послідовності в їх геномі.

Спрощено виявлена структура виглядала так:

На той момент ніхто не розумів, навіщо потрібні ці структури. Зійшлися на тому, що вони необхідні для якоїсь регуляції (стандартне «пояснення» в біології, коли нічого не зрозуміло). Структурам спочатку дали назву SRSR (Short Regularly Spaced Repeats), а потім перейменували в CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats).

Продовживши роботу в тому ж напрямку, Мохіка знайшов схожі повтори у багатьох інших бактерій. І ця закономірність привернула увагу.

У 2002 році поряд з CRISPR-масивами у всіх бактерій виявили схожі на них структури - групу білок-кодуючих генів, яку назвали «дуже оригінально» - CAS (CRISPR-Associated Genes).

Просунутися далі допоміг свого роду «генетичний Google»: GenBank, куди вчені складують всі прочитані послідовності ДНК. До початку 2000-х років там накопичилося вже достатньо інформації, щоб за допомогою алгоритмів BLAST знайти, в яких організмах зустрічаються схожі CRISPR-послідовності.

Пошук виявив цікаву річ: фрагменти CRISPR зустрічаються в ДНК бактеріофагів - вірусів, які інфікують бактерії і вбивають їх. Виходить, що бактерії зберігають всередині себе фрагменти ДНК своїх лютих ворогів.

Так виникла ключова думка про те, що CRISPR - це імунна пам'ять бактерій, які зберігали інформацію про віруси, якими хворіли.

Сформулювавши цю теорію, Мохіка почав писати статтю, яку відправив у найпрестижніший біологічний журнал - Nature. Статтю відхилили. Потім він намагався її прилаштувати в чотири інших журнали, але успіху домігся лише через 18 місяців.

До речі, в цьому він далеко не рекордсмен. Свого часу роботу Лінн Маргуліс, що запропонувала популярну нині гіпотезу симбіогенезу, відхиляли 15 разів! Можна сказати, що Мохіка пощастило. Його роботу опублікували швидше, а ідея знайшла своїх прихильників.

Основна функція CRISPR

Наступний крок у розвитку технології зробив мікробіолог Філіп Хорват. У своїй докторській роботі він досліджував закваски до ельзаської квашеної капусти, а якщо точніше - молочнокислі бактерії, які її квасять.

Після докторської він почав працювати в молочній промисловості, де зіткнувся з проблемою бактеріофагів. Вони сильно шкодили культурі закваски, виробники молочних продуктів несли величезні збитки. Ховарт шукав способи зробити закваски стійкими до бактеріофагів і наткнувся на роботи про CRISPR. Досліджуючи цю тему, він довів, що стійкі до вірусів бактерії переймають частину їх ДНК.

Бактеріальна клітина, яка перенесла інфекцію бактериофагом і не померла, нарізає його геном на дрібну «вермішель», вбудовує в CRISPR-масиви і передає цю інформацію своїм нащадкам, які стають стійкими до бактеріофагу.

Пізніше компанію, в якій працював Хорват, купила корпорація DuPont. А оскільки вона виробляє приблизно 40% заквасок для сучасної молочної промисловості, ви практично напевно стикалися з CRISPR в складі йогуртів, піци або сиру.

Роботи Хорвата показали, що CRISPR-масиви - це дійсно імунна система бактерій.
Це працює так: шматочки ДНК бактеріофагів зберігаються в ДНК бактерій у вигляді CRISPR-масивів. Потім вони перетворюються в РНК. У цьому ж шматку генома у бактерій кодується так звана тракр-РНК (tracrRNA). Разом вони формують guideRNA, або апрямовуюча РНК, яка потім об'єднується з білком Cas9.
Cas9 - це нуклеаза, фермент, який вміє розрізати ДНК. За допомогою guideRNA цей фермент наводиться на специфічний сегмент в ДНК бактеріофага, сідає на нього і розрізає, як ножицями, чим порушує розмноження вірусу.

Нобелівська стаття по редагуванню генів

Коли дві чудові жінки-вчені Еммануель Шарпантьє і Дженніфер Даудна зустрілися на конференції в Коста-Ріці, призначення CRISPR вже було відомо. Їм прийшла в голову смілива ідея: пристосувати цю систему для розрізання будь-яких ДНК. Вони об'єднали сили своїх лабораторій і в 2012 році в журналі Science опублікували результати роботи.

Їм вдалося об'єднати дві РНК в одну single guide RNA і показати, що механізм розрізання працює.

Тут треба пояснити, що розрізання - це і є основний етап редагування ДНК. А CRISPR - генетичні ножиці. Всі деталі нижче.

За цю роботу в 2020 році вони отримали Нобелівську премію з хімії.

Ця подія є унікальна за двома параметрами.

По-перше, це перша премія, яку отримали дві жінки без супроводжуючої чоловічої компанії.
По-друге, ця премія дуже «швидка». З моменту публікації до її присудження пройшло всього вісім років.

Вплив технології CRISPR найпростіше проілюструвати, показавши частоту згадок цієї абревіатури в науковій літературі, яка після 2012 року зростає як на дріжджах.

Другий показник - кількість патентів.

Ця статистика показує, наскільки все змінилося. Технології редагування генома пропонувалися і раніше, але жодна з них не досягла такого успіху.

Як відбувається редагування ДНК
Перша Нобелівська стаття демонструвала редагування ДНК в пробірці. Перед ученими стояло амбіційне завдання - повторити процес в клітинах людини. Фен Чжан з MIT оптимізував процес, зробивши його сумісним з живими клітинами, у яких є ядра.

У 2013 році після публікації роботи Чжана ця тема стала домінуючою. З'явилися повідомлення про те, що відредагували геном людини, миші, дріжджів, німатод, дрозофіли, резуховидки Таля, рибки даніо-реріо - всіх наявних у біологів модельних об'єктів.

Важливо розуміти, що ДНК - це дуже стабільна молекула. Її можна кип'ятити або залишати лежати в землі на сотні тисяч років.

Найстаріша секвенована ДНК на сьогоднішній день має вік 1,7 млн років.

Однак молекула ДНК дуже чутлива до розривів. Якщо це трапляється, клітина запускає процес лагодження ДНК. Він може йти двома шляхами:

• Не гомологічний варіант - коли місце розриву усувається з дефектами. В результаті в ДНК може з'явитися маленька вставка або відбутися втрата фрагмента. Генетичний код - це триплети, тобто три нуклеотиди кодують одну амінокислоту. Якщо ви вирізали два або вставили чотири нуклеотиди, порушиться послідовність, що кодує білок. Виникне зрушення рамки зчитування, в результаті якого ген фактично перестане виконувати свою функцію, так як клітина не зможе використовувати його інформацію, щоб синтезувати функціональний білок.

Зламати ген можна було і раніше, просто це є досить трудомістким: треба опромінювати гени радіацією, місяцями шукати мутації. Завдяки CRISPR процес став набагато простішим.

• Гомологічних рекомбінація. У всіх тварин в клітинах як мінімум дві копії кожної хромосоми. Якщо виникає розрив, клітина може використовувати другу хромосому і на її підставі добудувати пошкоджену ділянку - скопіювати його в пошкоджену хромосому. У цій ситуації клітину можна обдурити і підсунути їй замість другої хромосоми схожий фрагмент ДНК, але з мутацією. Тоді клітина полагодить розрив, вмонтувавши в нього те, що ми підсунули, - так звану матрицю.

За рахунок прицільно внесеного розриву, який робить CRISPR, з'явилася можливість дуже просто і ефективно замінювати фрагменти в геномі - вносити строго певні мутації і лагодити зламані гени. Але є проблема: репарація найчастіше проходить по не гомологічному шляху. Існують різні методи, що дозволяють зрушити процес в сторону гомологічної реплікації, але поки вони працюють не дуже добре.

Технології редагування генома існували і раніше. Але вони вимагали збірки так званих кастомних білків - під замовлення. Для кожної операції потрібно було збирати новий білок. Це займало кілька тижнів і навіть місяців. Коштував кожен такий білок кілька тисяч євро. А CRISPR-реагенти коштують 10-20 євро - в сотні разів менше. Стало можливим проводити експерименти набагато швидше і у величезних масштабах. Якщо вам в неділю прийшла хороша ідея, то через тиждень у вас вже буде клітинна лінія з готовою мутацією, - і ідею можна буде перевірити.

Природно, це підштовхнуло розвиток біотехнологій і промисловості. З'явилися тисячі компаній, які намагаються комерціалізувати CRISPR. Паралельно йде патентна війна між MIT і Університетом Берклі, де працює Дженніфер Даудна.

Застосування CRISPR-Cas9

Що можна зробити за допомогою CRISPR? Можна зламати, полагодити, замінити практично будь-який ген в геномі. Факт: біологи люблять ламати гени, щоб з'ясувати, як вони працюють.

Можна зробити хромосомну перебудову. Це дуже важливо в онкології, де ряд захворювань викликають хромосомні перебудови.

На наступному етапі технологію поліпшили, позбавивши Cas-нуклеазу активності - зробили її не ріжуть. Одночасно «пристебнули» до неї інші ферменти. У підсумку вона просто сідає на строго певний фрагмент ДНК і може його редагувати, не викликаючи ушкоджень. Наприклад, міняти азотисті основи без внесення розривів в ДНК, що дуже важливо для біомедичних задач.

Вчені вже навчилися активувати або репресувати роботу гена - редагувати Епігеном. Відомо, що деякі гени в організмі метиловані, крім того, існують спеціальні білки - гістони, які пов'язані з ДНК. Все це визначає, як поводиться клітина. CRISPR дозволяє впливати і на це.

За допомогою CRISPR можна виробляти високоточну мікроскопію ділянок геному. Це створює величезні можливості для вивчення і справжній вибух технологій, який до 2012 року неможливо було собі уявити.

Редагуємо корів, собак і помідори

Для чого ще використовується подібне редагування? Наприклад, плями у породи корів зробили з чорно-білих сіро-білими. Вважається, що так вони краще переносять спеку.

Собакам породи бігль додали м'язів. Практичний сенс цієї, без сумніву, великої роботи не зрозумілий. Але роботу виконували китайці. Можливо, у них своє уявлення про прекрасне.

Людських органів для пересадки завжди не вистачає, тому пересаджують органи свиней. Але тут є проблема: у них в геномі присутні багато сплячих ретровірусів, які після пересадки можуть активуватися і загрожувати здоров'ю пацієнта. У свинок на фото ці фрагменти в геномі інактивувати.

Ще приклад: за допомогою CRISPR відредагували кількість розгалужень на гілці помідорів. А також розміри плодів. Все це на фото вище.

Відредагованих рослин вже дуже багато. Масштаби можна уявити за кількістю публікацій у наукових журналах.

Але в магазинах (принаймні в Європі) CRISPR-модифікованих продуктів немає. Це пов'язано виключно з обережністю регулятора, що є зайвим.

Раніше генетично модифіковані продукти в Європі забороняли, бо не знали, що станеться, якщо ці модифіковані рослини потраплять в дику природу. Може бути, якщо генно-модифікована кукурудза «увірветься» в ліси, там вимруть всі берези. Також не знали, як вони вплинуть на здоров'я людини в довгостроковій перспективі, тому що при модифікації використовували генетичні елементи з інших організмів.

CRISPR дозволяє вносити мутації, не залишаючи слідів, оскільки введені РНК і білок в клітині деградують. Від них нічого не залишається, зберігається тільки сама мутація. Фактично CRISPR робить те ж саме, що відбувається при селекції. Незважаючи на це, суперобережні регулятори вирішили, що дозволяти CRISPR поки не варто.

Наприклад, вивести посухостійкі або більш продуктивні сорти рослин, які дозволять використовувати менше орних земель, не застосовувати пестициди або добрива.

CRISPR в біомедицині

Найбільш хвилююче питання - застосування CRISPR в біомедичних дослідженнях для поліпшення життя хворих людей (а може, і здорових - в перспективі). Головна складність тут - в доставці «генетичних ножиць» в клітини людини. Припустимо, нам потрібно полагодити непрацюючий ген, який викликає хворобу. Але лагодити його треба в цілому органі або навіть у всьому тілі.

Наприклад, мутацію, що викликає діабет, треба лагодити у всій підшлунковій залозі. Це непросто, тому що клітини прекрасно себе захищають від вторгнення чужорідної ДНК. Тому дослідники почали з тих речей, які можна з людини вийняти, відредагувати в пробірці, потім розмножити і повернути назад, - з кісткового мозку і крові.

Тут показано, як за допомогою CRISPR лікують бета-таласемії і серповидноклітинну анемію.

Ці хвороби викликані двома різними мутаціями в гені бета-гемоглобіну.

Хворим бета-таласемією потрібні часті переливання крові. У хворих серповидноклеточной анемією еритроцити забивають судини. Якість життя у них низька, і є ризик ранньої смерті.

Що в такій ситуації дозволяє зробити CRISPR? У людини є третій ген гемоглобіну - фетальний гемоглобін, який активний лише у ембріонів до народження. Після народження він вимикається, працюють дорослі альфа- і бета-гемоглобіни. CRISPR дозволяє включити ген фетального гемоглобіну - вимкнувши ген, який його контролює.

У двох хворих жінок забрали клітини кісткового мозку і за допомогою вірусу впровадили в них CRISPR-конструкцію, яка інактивувати ген BCL11A. У цих клітинах заробив фетальний гемоглобін. Правильно відредаговані, відселектований і розмноження клітини повернули пацієнтам назад - пересадили їм їх же кістковий мозок. Після цього пацієнтці з бета-таласемією, якій потрібно було в середньому 16 переливань крові в рік, протягом року не знадобилося жодної процедури. Те ж відбулося і з хворої серпоподібноклітинної анемією - їх реально вилікували.

Ці роботи перейшли на наступну стадію клінічних випробувань - найближчим часом цей метод може увійти в повсюдну практику.

Наступним напрямком роботи - терапія ВІЛ. Є люди, які не заражаються вірусом імунодефіциту людини за рахунок мутації в гені CCR5 - делеции в 32 нуклеотиду. Якщо у людини обидві копії гена мутували, вірус просто не може проникнути в їх клітини.

У частини пацієнтів на тлі ВІЛ розвивається лімфобластний лейкоз (рак крові). Якщо інші методи терапії не допомагають, хворим лімфобластний лейкоз часто пересаджують кістковий мозок. В цьому випадку взяли кістковий мозок у донора, який підходив для лікування лейкемії.

Перед пересадкою клітини відредагували за допомогою CRISPR, вимкнувши в них ген CCR5, - повторили мутацію, яка існує в природі. Пересадка вилікувала пацієнта і від лейкозу, і від ВІЛ.

Це одна з найяскравіших демонстрацій можливостей CRISPR.

CRISPR і етика

Кажучи про ВІЛ, не можна не згадати про найбільш гучний випадок використання CRISPR. Це історія 2018 року. Винуватець подій - Цзянькуй Хе, китайський вчений, який провів експеримент з редагуванням людських ембріонів.

Отримавши ембріони від пар, де батьки були інфіковані ВІЛ, він спробував за допомогою CRISPR вимкнути в них ген CCR5. В результаті експерименту народилося троє зовні здорових дітей.

Однак відбулося лише часткове редагування. У однієї дівчинки перша копія гена вийшла з 15-нуклеотидною делецією, чого виявилося недостатньо, щоб ген перестав функціонувати. А друга копія гена - без змін. В результаті ніякого захисту дівчинка не отримала. З іншою дівчинкою вийшло краще, але ген все одно залишився частково функціональним.

Проблема цього експерименту - в порушенні етичних норм і законів. Як з'ясувалося, Цзянькуй Хе фальсифікував дозвіл етичної комісії, яка не схвалила це дослідження. У всіх країнах у нормальних вчених це означає повну заборону, але він його проігнорував. Крім того, експеримент був погано підготовлений, дослідник не зважив можливі ризики. Редагування толком не вийшло, а наслідки цих експериментів можуть проявити себе пізніше. CRISPR не володіє стовідсотковою точністю, він може вносити мутації десь ще в геномі. І де він їх внесе, передбачити складно.

Якби всі діти з ВІЛ вмирали, це змінювало б справу. Але з сучасними препаратами ВІЛ-інфіковані матері народжують ВІЛ-негативних дітей більш ніж в 90% випадків. Тому експеримент був ще і безглуздий.

Жоден учений в світі не сумнівався, що технічно метод CRISPR дозволяє редагувати ембріони, тобто наукової новизни в цьому експерименті теж не було. Але це треба було робити з дотриманням всіх норм і іншим рівнем підготовки. А головне, технологія ще недостатньо дозріла, щоб зі стовідсотковою гарантією відредагувати тільки потрібне місце в геномі і нічого не зламати в інших.

Громадянин Хе підірвав віру в вчених, отримавши вал критики, майже півмільйона доларів штрафу і три роки позбавлення волі.

Я думаю, до широкої практики редагування людських ембріонів нам далеко. Але, безумовно, колись ми до цього прийдемо, і за допомогою CRISPR лікуватимуть важкі спадкові захворювання.

Кому зараз доступний CRISPR

В інтернеті за невеликі гроші можна купити набір, де є все необхідне.

Якщо у вас є хоч трохи обладнана лабораторія для найпростіших молекулярно-біологічних експериментів, почати працювати з CRISPR буде легко. І це дійсно фантастичний інструмент, який неймовірно прискорив прогрес біомедичної науки.

Вся ця історія вчить нас тому, що навіть длубаючись - буквально - в багнюці, можна зробити неймовірні відкриття. Ну і ще тому, що наука інтернаціональна.

Та ж Еммануель Шарпантьє працювала спочатку в Нью-Йорку, потім в Мемфісі, в Відні, в Швеції, в Ганновері, а прямо зараз працює в Берліні. Тому завдання вченого - знати хоча б одну міжнародну мову і намагатися розвивати власну мобільність - рухатися, шукати зв'язки і співробітників, нових колег. Шарпантьє і Даудна зустрілися на конференції, зацікавилися спільною проблемою і в підсумку отримали Нобелівську премію. Хто знає, як би склалася історія CRISPR, якби не було цієї зустрічі.